1.一种MALDI‑TOF MS的飞行时间校准方法，其特征是，其包括：

　　根据实际检验测试谱图中的各质谱峰与理论飞行时间图谱中各质谱峰的位置分别构造空

　　间向量，以实际检验测试谱图中的采样点数量为向量维度总量；其中，所述理论飞行时间图谱由

　　构造动态变化的飞行时间差Δt，将所述实际检测谱图中的各质谱峰构造的空间向量

　　各分量向前或向后移动飞行时间差Δt形成新的修正向量，利用余弦相似性算法对所述修

　　正向量和所述理论飞行时间图谱中各质谱峰构建的理论空间向量进行相似性比较，得到相

　　似性最高的所述修正向量，获得相似性最高的所述修正向量对应的修正飞行时间差Δt

　　2.根据权利要求1所述的飞行时间校准方法，其特征是，将所述理论飞行时间图谱中

　　3.根据权利要求1所述的飞行时间校准方法，其特征是，所述理论飞行时间图谱中各

　　质谱峰的位置在空间向量中标记为“1”，其余位置用ADC采集卡的采样间隔时间补齐采样

　　点，并标记为“0”，所述实际检验测试谱图中的各质谱峰则以各质谱峰的信号强度数据构造空间

　　4.根据权利要求3所述的飞行时间校准方法，其特征是，余弦相似性算法的计算过程

　　取值为ADC采集卡的采样间隔时间或ADC采集卡的采样间隔时间的整数倍数。

　　经多重PCR扩增和单碱基延伸技术前处理的核酸样品，所述待检测样品中的已知物质包括

　　中已知物质的理论质荷比转换为理论飞行时间的实现方式为：先通过外标法或内标法校正

　　得到质荷比与飞行时间的转换参数，然后根据所述转换参数将所述已知物质的理论质荷比

　　8.根据权利要求7所述的飞行时间校准方法，其特征是，通过采用外标法校正得到质

　　9.根据权利要求8所述的飞行时间校准方法，其特征是，所述实际检验测试谱图为通过所

　　本发明涉及生物软电离质谱技术领域，具体而言，涉及一种MALDI‑TOF MS及其飞

　　基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI‑TOF MS）是近年来发展起来的一

　　种新型的生物软电离质谱技术，具有样品处理简单、检测通量高、快速准确、灵敏度高等优

　　点，现在已经成为多肽、蛋白质、核酸等生物大分子检测的有效工具。利用双脱氧核苷酸3’端复

　　制终止特性的单碱基延伸技术搭载MALDI‑TOF MS而建立的核酸质谱检测系统将高精确度

　　的质谱技术与计算机智能分析功能结合，成为了单核苷酸多态性（SNP）、基因突变、DNA甲基

　　核酸质谱检测具体检验测试过程如下：利用自动点样装置将经多重PCR扩增和单碱基

　　延伸技术前处理的样品转移至样品靶上，待样品与基质在样品靶上自然风干形成共结晶

　　体。然后将样品靶放入仪器中等待检测，在检测软件中创建谱图采集任务，导入包含样品中

　　延伸引物和延伸产物分子量的Assay文件，开始采集任务。样品与3‑HPA基质在靶板形成共

　　结晶薄膜，通过激光照射共结晶体使得样品离子化，产生不同质荷比的离子，然后再经过质

　　量分析器测定该样品中不一样的种类离子的分子量，并在3000‑10000 Da质量范围内按照从小

　　到大的顺序依次排列从而得到一幅质量图谱。分型分析软件根据导入的Assay文件各样品

　　响软件的判型结果，进而导致假阳性或假阴性的诊断结果。特别地，MALDI‑TOF的最终谱图

　　由叠加而成，若单张谱图质谱峰存在一定偏差，经累加，最终谱图的质量精度可能会大幅度

　　下降。由于MALDI‑TOF MS通过激光轰击样品和基质在靶板上形成的共结晶的方式进行电

　　离，激光轰击共结晶后使离子产生位置分散，在这种情况下，若共结晶分布不均匀，必将导

　　致离子位置分散更大，通过仪器检验测试参数的调整，可以在某些特定的程度上减少样品结晶不均匀

　　带来的分辨率和质量精度影响，但无法完全消除。此外，共结晶体具有一定高度，激光连续

　　轰击结晶点，表面的样品离子与结晶内部离子的高度差也会促进降低质量精度。

　　除结晶形貌带来的影响外，靶托、靶板以及仪器X‑Y移动平台加工精密度不够也同

　　样是谱图质量精度低的重要原因。核酸质谱的靶板通过磁铁紧贴在靶托上，靶板与靶托的

　　贴合程度、靶板表面平整度、靶托的平整度均是质量精度不佳的影响因素。靶托和靶板的形

　　变会改变离子引出场的距离，导致离子飞行路径发生明显的变化，造成同种离子的飞行时间差异，

　　来改善样品与基质的共结晶体的均匀性而提高质量精度。而共结晶均匀性受多重因素的影

　　响，如基质选择、靶板材料以及表面处理技术、结晶干燥条件（真空/室温/通风/加热）等。例

　　如，Chao‑Jung  Chen等人通过在靶板表面覆盖一层聚二甲基硅氧烷疏水层，缩小了样品点

　　的面积，使分析物结晶均匀性得到了一定提升，同时增强了分析物的质谱信号。而对于靶板

　　形变带来的质量精度影响，不锈钢靶板的可重复使用特性，增加了靶板产生不规则形变的

　　可能性，而硅基芯片靶板由标准晶圆片制成，其表面平整度小于1μm，同时硅基芯片靶板为

　　一次性耗材，避免了多次使用而导致磨损形变的问题，这在某些特定的程度上保证了质量精度。虽

　　然更换靶板改善了质量精度，但仍没有办法解决加工工艺不佳所致的样品靶或X‑Y移动平台形

　　重点转向了校准算法。校准算法通过修正飞行时间与质荷比的转换关系，调整谱图质量轴，

　　提高质量精度。飞行时间与质荷比的转换关系的原理为能量守恒定律，即离子动能等于离

　　外标法的校准是指在样品靶的不同位置上点已知质荷比的标准品，通过标准品飞行时间与

　　理论质荷比之间的线性关系取得相应的校准参数，然后调整其他样品质谱峰，提高质量精

　　度。在微生物鉴定中，有研究表明，通过在不锈钢板上选取不同位置做外标法校准，使质

　　量精度在200ppm以内，可保证微生物鉴定的准确性。这样的外标法能够对校准点附近的靶

　　点起校准作用，但对于离校准点较远的靶点校准效果有限。另外，即使标准品与样品的点样

　　均由自动点样仪完成，也很难保证标准品与样品的结晶高度完全一致。内标法，顾名思义就

　　是在样品中加入校准标准品，利用谱图中标准品的质谱峰对样品峰进行校正。虽然与外标

　　法相比，内标法的校准效果更加好，但其也具有一定的局限性。在加入标准品前，需要先了解

　　样品中物质，以免加入的标准品与样品中的物质发生反应或产生干扰峰。同时，标准品在样

　　本中的含量需根据样品含量做调整，若标准品浓度过高，会对样品离子峰产生抑制作用，

　　而标准品浓度过低，将难以被检测到，失去校准的意义。此外，核算检验测试需在3000‑10000  Da

　　质量范围内通过穿插的方式设计引物以实现40重检测的目的，在样品中加入校准品无疑增

　　本发明的目的是提供一种MALDI‑TOF  MS及其飞行时间校准方法，以改善上述技

　　第一方面，本发明提供了一种MALDI‑TOF  MS的飞行时间校准方法，其包括：

　　别构造空间向量，以实际检验测试谱图中的采样点数量为向量维度总量；其中，理论飞行时间图

　　各分量向前或向后移动飞行时间差Δt形成新的修正向量，利用余弦相似性算法对所述修

　　正向量和所述理论飞行时间图谱中各质谱峰构建的理论空间向量进行相似性比较，得到相

　　似性最高的所述修正向量，获得相似性最高的所述修正向量对应的飞行时间差Δt

　　造动态变化的飞行时间差Δt，利用余弦相似性算法对理论和实际检测峰谱图中的飞行时

　　样品靶和移动平台平整度引起的飞行时间漂移，进而提高了仪器的质量精度。同时，该方法

　　无需像内标法那样在样品中加入内标物，不对样品的检测造成影响，且使用的是样品序列

　　图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对

　　范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这

　　的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建

　　议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为能够最终靠市售购买获得的常规产

　　下面对本发明提出的一种MALDI‑TOF  MS及其飞行时间校准办法来进行具体说明。

　　本发明的一些实施方式提供了一种MALDI‑TOF  MS的飞行时间校准方法，其包括：

　　别构造空间向量，以实际检测谱图中的采样点数量为向量维度总量；其中，理论飞行时间图

　　中代表质谱峰位置的标记值向前或向后移动飞行时间差Δt形成新的修正向量，利用余弦

　　相似性算法对修正向量和所述理论飞行时间图谱中各质谱峰构建的理论空间向量进行相

　　似性比较，得到相似性最高的修正向量，获得相似性最高的修正向量对应的飞行时间差Δ

　　发明人通过对MALDI‑TOF  MS的检测机理进行了研究和实践，开拓性地提出了一种

　　通过算法校正就可以实现对样品因结晶差异或样品靶和移动平台平整度引起的飞行时间漂

　　移进行修正的方法，进而提高了仪器的质量精度。该飞行时间校准方法的基础原理为：利用

　　已知理论峰对检测样品进行飞行时间的校准，构造动态变化的飞行时间差Δt，校准后的飞

　　具体地，本发明的一些实施方式提供的MALDI‑TOF  MS的飞行时间校准方法包括：

　　S1、在靶板上点标准品进行外标法的校准，得到仪器关于样品飞行时间t和m/z之

　　并获得相应的质谱图，标准品对应的质谱图为校准谱图，通过校准谱图得到样品飞行时间t

　　和m/z之间的校准参数，得到外标法修正方程，并以之校准待检测样品的质谱图，以消除仪

　　需要说明的是，通过外标法校准时，待检测样品的数量通常为多个，且在靶板上的

　　位置均匀阵列分布，正常的情况下，标准品点的位置位于中部位置，以尽量提高校准的精度。

　　此外，一些其他实施方式中，该步骤中，也能够最终靠内标法校正得到质荷比与飞行

　　一些实施方式中，靶板选择为硅基芯片靶板，其为一次性耗材，避免了多次使用而

　　S2、根据外标法校准得到的飞行时间t和质荷比m/z的修正方程，将理论飞行时间

　　图谱中待检测样品中已知物质的理论质荷比转换为理论飞行时间来构建得到理论飞行时

　　一些实施方式中，待检测样品为经多重PCR扩增和单碱基延伸技术前处理的核酸

　　样品，待检测样品中的已知物质包括延伸引物和延伸产物。例如，在核算检验测试中，将Assay文

　　件中延伸引物与延伸产物的理论质荷比转换为理论飞行时间，得到引物与产物峰的横坐标

　　进一步地，一些实施方式中，待检测样品为病毒样品，优选地，病毒样品为HPV样

　　S3、结合实际检测谱图中的各质谱峰与理论飞行时间图谱中各质谱峰的位置分别

　　各质谱峰的空间向量进行比较，则需要将其转化为归一化的向量，例如，将理论飞行时间图

　　谱中各质谱峰的位置在空间向量中标记为“1”，其余位置用ADC采集卡的采样间隔时间补齐

　　采样点，并标记为“0”，而实际检验测试谱图则以各质谱峰的信号强度数据构造空间向量。

　　S4、构造动态变化的飞行时间差Δt，将实际检验测试谱图中的各质谱峰构造的空间向

　　量中代表质谱峰位置的标记值向前或向后移动飞行时间差Δt形成新的修正向量，利用余

　　弦相似性算法对修正向量和理论飞行时间图谱中各质谱峰构建的理论空间向量进行相似

　　性比较，得到相似性最高的修正向量，获得相似性最高的修正向量对应的飞行时间差Δ

　　具体地，飞行时间差Δt的取值为ADC采集卡的采样间隔时间或ADC采集卡的采样

　　间隔时间的整数倍数，当飞行时间变化Δt，质谱峰整体对应的空间向量能做到调整。

　　进一步地，以上步骤中应用到了余弦相似性算法，其基本概念为：在向量空间中，

　　通过测量两向量夹角的余弦值来判断两向量的相似性，余弦值接近1，夹角趋于0，表明两个

　　向量越相似，余弦值接近于0，夹角趋于90度，表明两个向量越不相似。其计算过程如下：

　　例如，参见图1，以核算检验测试为例，构造动态变化的飞行时间差Δt，则校准后的飞

　　前或后移动而形成新的修正向量，然后利用余弦相似性算法对修正和理论向量进行相似性

　　比较。此过程循环进行，直至得到与理论向量相似性最高的修正向量，此时修正向量对应的

　　谱的基础上进行了二次校准，而一些实施方式中，也可以直接通过以上步骤S3来直接对实

　　任一实施方式的飞行时间校准方法的程序。其通过程序能对实际检验测试谱图进行校准后，

　　将12例HPV样品在硅基芯片靶板12个蓝色标记位置上进行点样，在红色标记位置

　　9006.9、9022.9、9938.5）的混合标准品（如图2所示），并获得相应的质谱图，红色点E7的质

　　2=1），并以之校准其他HPV样品的质谱图，校准后对比不同位置上的HPV样本有的14个

　　的偏移方向相同，偏差主要在400ppm至‑600ppm之间变化，其中A11位置上的样本质量偏差

　　超过了1000ppm，通过观察发现，A11这个点的结晶较其他结晶点厚，并且离校准点较远，表

　　明外标校正后的谱图仍存在比较大偏差，这可能可以归因于样品靶形变与样品点结晶差异。

　　将经外标法校准的HPV样品实际检验测试谱图进行基于其样品序列理论峰对齐算法的

　　再次校准，具体过程为（以D11样品点的校准过程为例）：HPV样品在Assay文件中引物与产物

　　具体如表1所示；将外标法校准后的实际检验测试谱图中的各质谱峰与理论飞行时间图谱中各

　　质谱峰的位置分别构造空间向量，分别为理论向量 和实际检验测试向量 （ 、 均为27000

　　个分量）。理论向量 为（0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，

　　0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，

　　0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，

　　0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…，0，1，0，…），对应出峰

　　的位置即位置处“1”对应的时间分别依次为10921纳秒，11379纳秒,11782纳秒,11915纳秒,

　　秒,15468纳秒,15682纳秒等。实际检验测试向量 （对应信号强度mV）为：

　　中各分量向前或向后移动飞行时间差Δt形成新的修正向量，利用余弦相似性算法对修正

　　向量和理论飞行时间图谱中各质谱峰构建的理论空间向量进行相似性比较，采用公式

　　图4为D11样品点质谱峰经二次校准前后的谱图，从两谱图的叠加对比可明显看